黄酮类化合物是激素吗_HPLC法测定6种蝗虫中黄酮类化合物

来源:学习计划 发布时间:2019-07-17 点击:

  摘要:以长额负蝗、短额负蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中华稻蝗和中华蚱蜢6种蝗虫为材料,以芦丁作为标准品,探索了高效液相色谱法测定蝗虫中黄酮类化合物含量的方法。色谱条件为色谱柱C18(5 μm,250 mm×4.6 mm),流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50,V/V),进样量10 μL,流速1.0 mL/min,柱温25 ℃。检测得到长额负蝗、短额负蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中华稻蝗和中华蚱蜢中的黄酮类化合物含量分别为11.201、13.776、5.035、13.827、5.565、7.181 mg/g。该方法简便、准确、重现性和稳定性较好,可用于测定蝗虫中黄酮的含量,结果表明蝗虫是黄酮类化合物含量很高的资源生物,进一步研发具有广阔前景。
  关键词:蝗虫;黄酮类化合物;提取;测定;高效液相色谱
  中图分类号:O657.7+2 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2013)19-4785-04
  黄酮类化合物(Flavonoids)是广泛存在于植物体的一大类化合物,目前已知种类达8 000多种。研究证明黄酮类化合物主要有以下生物学作用:保护心脑血管系统、调节免疫、抗癌抗肿瘤、抗炎镇痛、抑菌抗病毒、抗氧化、抗辐射等[1-4],是目前保健品中添加量最多的功能性物质之一。蝗虫属直翅目昆虫,世界上现已记载的蝗虫种类多达10 000种,我国已知蝗虫超过1 000种[5-7]。蝗虫不仅具有非常好的资源优势,还具有丰富的功能成分。见诸报道的研究包括功能性脂肪酸和磷脂的研究;抗冻蛋白、储存蛋白、热休克蛋白的研究[8-11];但鲜见有从蝗虫中分离纯化出黄酮类物质的报道[12-20]。
  本研究通过对长额负蝗[Atractomorpha lata (Motschoulsky)]、短额负蝗(A. sinensis Bolivar)、斑角蔗蝗(Hieroglyphus annulicomis Shir)、山稻蝗(Oxya agavisa Tsai)、中华稻蝗[O. chinensis (Thunberg)]和中华蚱蜢[Acrida cinerea (Thunberg)]6种蝗虫中黄酮类化合物的提取工艺进行优化,建立了提取物高效液相色谱检测方法,并测定其黄酮类化合物的含量,为蝗虫黄酮类化合物资源的综合开发利用提供理论依据。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  试验材料分别采集于湖北省黄冈市英山县和黄州区(表1)。
  1.2 试剂
  芦丁(阿拉丁试剂公司,批号为1108860),甲醇(色谱纯),磷酸;石油醚(沸程30~60 ℃)、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、正丁醇、三氯化铝、浓氨水等均为分析纯;超纯水。
  1.3 仪器
  高效液相色谱仪(2695,美国Waters公司),配备二极管阵列检测器;色谱柱,Symmetry 300TM C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm,美国Waters公司);电热恒温鼓风干燥箱(GZX-9240MBE,上海博讯实业有限公司医疗设备厂);快速粉碎机(GDYQ-704S,广州市深华生物技术有限公司);超声波清洗器(KQ-500DB,昆山市超声仪器有限公司);电子天平(AB204-E,上海精细天平有限公司);脂肪测定仪(SZF-06A,上海精隆科学仪器有限公司);循环水真空泵(SHZ-Ⅲ型,上海亚荣生化仪器有限公司);旋转蒸发仪(RE-52AA型,上海亚荣生化仪器有限公司)。
  1.4 试验方法
  1.4.1 工艺流程 工艺流程参照文献[12],流程如下:山稻蝗经鉴定后-40 ℃冷冻处死,保存,试验时称取冷冻山稻蝗,去消化道后放入烘箱中干燥至恒重,再将烘干的山稻蝗进行粉碎过40目筛,密封包扎备用;以石油醚为脱脂剂,将粉末用于脂肪测定仪于70 ℃恒温回流6 h以脱去脂肪,残渣挥去石油醚后干燥备用;准确称量(1.0 g)脱脂山稻蝗粉末水浴回流提取黄酮,进行正交试验。
  1.4.2 高效液相色谱测定 参照文献[20]的方法,稍作调整。将提取的黄酮溶液用甲醇稀释10倍,过0.22 μL微孔有机滤膜后备用。色谱条件为Symmety C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相:甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50,V/V);流速:1.0 mL/min;检测波长:268 nm;色谱柱温:25 ℃;进样量:10 μL。
  2 结果与分析
  2.1 蝗虫黄酮提取工艺优化
  2.1.1 单因素试验 分别探索不同有机溶剂、甲醇浓度、浸提时间、浸提温度、料液比对提取效率的单因素试验。单因素试验结果表明,甲醇、甲醇浓度80%、浸提时间2.5 h、浸提温度75 ℃、料液比(1∶40,m/V)时对蝗虫黄酮的提取效果最好。
  2.1.2 正交设计优化 为更加全面考察各影响因素,设计了4因素4水平的正交试验,试验因素水平见表2。
  根据试验因素水平表进行正交试验,测得正交试验结果见表3。从试验数据分析可以看出,各因素对黄酮类化合物提取效果的影响大小为浸提时间>甲醇浓度>浸提温度>料液比。
  2.2 6种蝗虫黄酮的最佳提取工艺分析
  其他5种蝗虫的提取工艺试验探究及优化与山稻蝗的基本相同,经试验探究确定其最佳提取条件见表4。
  2.3 6种蝗虫中的黄酮含量分析
  通过试验确定高效液相色谱法测定黄酮条件及其相应含量见表5。
  从表5可以看出,不同种类的蝗虫黄酮类化合物含量差异较大,从蝗虫类群来看,斑腿蝗科的山稻蝗的含量最高,为13.827 mg/g,斑角蔗蝗和中华稻蝗的含量较低,其中斑角蔗蝗的含量最低,为5.035 mg/g;锥头蝗科负蝗属的2种蝗虫黄酮含量都较高;剑角蝗科中华蚱蜢含量居中,为7.181 mg/g。蝗虫黄酮类化合物的含量没有表现出分类类群的规律性,相关高效液相色谱图见图1-6。   2.4 加标回收试验
  取不同浓度的黄酮提取液0.5 mL,分别放入5支试管中,再分别加入芦丁标准品。其余步骤按“1.4.2”进行,测定其峰面积,计算其回收率为98.23%,检测方法的回收率都满足试验的要求。
  2.5 精密度试验
  准确量取黄酮甲醇溶液1 mL,其余步骤按“1.4.2”进行,测定其峰面积,重复5次。平行测定结果的相对标准偏差为0.87%,可满足试验要求。
  3 小结与讨论
  影响蝗虫中黄酮类化合物提取效果的主次顺序为:浸提时间>甲醇浓度>浸提温度>料液比。通过测定方法规范研究确定了HPLC法测定黄酮含量的条件为:色谱柱C18 (5 μm,250 mm × 4.6 mm);进样量为10 μL;流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50,V/V);流速为1.0 mL/min;试验测出的长额负蝗、短额负蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中华稻蝗和中华蚱蜢中的黄酮含量分别为11.201、13.776、5.035、13.827、5.565、7.181 mg/g。本测定方法较以往的方法更快速、简便、准确、实用性强。蝗虫含有丰富的黄酮类化合物,且种类间的差异较大。山稻蝗的含量最高,为13.827 mg/g,斑角蔗蝗的含量最低,为5.035 mg/g。由此可见,蝗虫是一种很好的天然黄酮源。
  目前有关黄酮类物质的主要研究对象为植物[15,16],关于动物中黄酮类物质的研究报道较少,所研究的蝗虫种类也很少,且蝗虫中黄酮类物质的含量测定多使用传统的比色法。应用高效液相色谱法对蝗虫中总黄酮的含量进行测定,该方法灵敏度高、准确、重现性好。该研究为蝗虫的黄酮类物质的综合开发利用提供一定技术参数与试验依据。本研究中6种蝗虫的黄酮类化合物含量远远高于霍山蹦蝗(0.41%)[12]和蜂蛹(0.45%)[17]的含量,甚至比常见的中草药如葛根(1.7%)[18]、木犀草(1.9%)[19]、银杏叶的黄酮含量[20,21](2.9%)都高。
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