用于定量分析分子动力学和分子相互作用双光子萤光相干光谱学

来源:演讲稿 发布时间:2020-03-02 15:41:42 点击:
- 用于定量分析分子動力學和分子相互作用的雙光子螢光相干光譜學 Keith M. Berland Physics Department, Emory University Atlanta, GA 30322-2430 E-mail kerlandphysics.emory.edu.tw 摘 要 由于螢光光譜學的多用途和高靈敏度,它越來越廣泛地被應用于生物學和生物物理學的研究。在合適的條件下,螢光光譜學測量可以準確地提供生物系統的物理化學和動力學特性。本文介紹了螢光光譜學的基本概念和理論,同時敘述了如何利用雙光子自動相干和雙光子雙色交叉相干螢光光譜測量分子動力學和分子的相互作用。應用實例包括定量分析蛋白質-蛋白質的相互作用,分子擴散的細胞外和細胞內測定,定量分析特定核酸的雜交反應。

本研究由Emory University Research Fund資助。

.-- 1. 引言 為了理解生物系統的生物和物理機制,定量分析生物分子的相互作用和相關的動力學是十分重要的,定量分析提供了一種重要手段去認識分子的結構,動態和功能。自從Magde等[1]首先將螢光相干光譜學fluorescence correlation spectroscopy應用于生物物理學測量后,螢光相干光譜學在這十年中已發展成為一種強有力的研究工具,它能定性和定量地分析生物分子的相互作用,化學反應,流體動力學和光物理特性等[2, 3]。由于實驗儀器的發展,共聚焦confocal和雙光子顯微two-photon microscopy可方便地檢測單個分子的螢光[4-6],因此螢光相干光譜法的優點也越來越明顯。在各種螢光光譜法應用中,利用共聚焦或雙光子螢光顯微的微小的觀測體積10-18 m3特性來監測螢光信號隨時間變化的波動functuation是最常見的手段[2, 7]。很多因素可導致這種自發性平衡波動,如擴散分子流出/流入觀測體,化學反應及光物理作用等。對于稀釋濃度10-9 M的樣品,觀測體積內任何時候的分子總數都很小1-1000,確保了相對于平均螢光信號的信號波動的獲得。從螢光信號的振幅和時間相干特性中可獲得許多有用的參數,如擴散系數和樣品中各種分子之間的連接特性等[8-10]。用螢光相干光譜法測量分子間相互作用的一大優勢在于,它是直接測量獨立的分子而不是間接測定分子間相互作用。因此,在用螢光相干光譜法測量相互作用時,不存在對相互作用分子重量的限制。共聚焦和雙光子螢光顯微鏡對各種螢光相干光譜法使用均十分有用。本文重點介紹雙光子螢光相干光譜學,雙光子螢光激發在生物學上的應用有著顯著的優勢[11-13]。如文中所討論的,雙光子螢光激發對雙色交叉相干dual-color cross-correlation測量特別有利。

2.理論 2.1概論 對于一種特定的分子,由雙光子激發所產生的螢光信號F隨激發信號強度的平方變化,如下式所示 1 其中a為入射光強,C為濃度,d為雙光子交叉截面,h為螢光量子產率,W為測量效率,S為激光空間分佈,尖括號為對時間的平均*。Veff表示測定體積,可由對S的積分得到。N為激發測量體積內的獨立分子的平均數。y表示分子的螢光亮度光子/分子/秒,它由分子的內在特性d, h和測量系統相關參數W, a決定,是確定螢光相干光譜法測試精度的最關鍵參數之一[14]。

在波動光譜學中,人們對映像測量中所見到的螢光強度隨時間變化的波動感興趣。以下給出了雙通道測量dual-channel detection的公式 2 因系統中不同種類分子的存在,用表示測量器通道 “n“ 如“紅“ 或 “綠“測量通道的總波動信號,表示不同分子的濃度在空間分佈的波動。為n測量通道中i種分子的亮度。螢光相干函數定義如下 自動相干 3 交叉相干 4 利用適當的代入,相干函數的公式可演繹為 5 對于自動相干測量,m和n相等。對交叉相干,m和 n則代表不同的測量通道。前置常數 g 取決于激發光源的空間分佈,參數Ai表示每種分子如何影響相干函數的 *如是脈沖激光高斯脈沖,P平均功率,fp循環率,t脈沖寬度。

隨時間變化特性,這些參數取決于波動信號的來源。在交叉相干測量時,只有 Yi,m 和 Yi,n 值同時不為零時才對式5有貢獻,所以多色探測方法能夠在複雜的異性樣品中有選擇性地測量那些特定的分子。

當所有分子的亮度參數均相同Y時,式5可以簡化為以下的形式式6。

6 顯然它和單一分子的相干函數相同,所以時間為零時的振幅仍和總的分子數成反比,這也體現了螢光相干光譜測量的“計量counting“特性。

要進一步推導相干函數,必須知道螢光波動的耒源和激發光源的空間分布。在螢光相干光譜測量中,激發光源的空間分布通常被描述成三維高斯分布3DG。

7 w0和 z0 分別是在聚焦平面和軸向的特征量。如上所述,有效的雙光子測量體積 [V3DG=p/23/2 w02z0, 0.1 mm3]可從歸一化的激發概率S2的全空間積分得到。在最基本的螢光相干光譜實驗中,螢光波動是因分子擴散運動進出測量體積而產生的。在獨立分子的自由擴散和激發光源具有三維高斯形狀的的條件下,參數Ai可用一無量綱量 ji = 4Dit /w02 來表示 , 8 我們用這一模型來分析實驗數據,獲得分子動力學和分子相互作用等信息。本文給出了几個應用實例,包括在細胞體內in vivo和細胞體外in vitro測量擴散系數,利用擴散分析和分子計量來量化分子的相互作用。

3.材料和方法 3.1 儀器 雙通道螢光探測系統是由對原單通道螢光相干光譜系統改進得到[7]。其基本設置見示意圖圖1。雙光子激發光源是一鎖模mode-locked Tsunami Ti sapphire 激光,它由一台5W固體激光來輔pumped。其發射波長可在700-1000 nm 之間調節,輸出循環率為 80 兆赫寬度約為100 10-15 s的脈沖波。一個Zeiss Thornwood, NY 63X C-Apochromat NA 1.2水浸沒透鏡被用來將激光聚焦在樣品上。根據不同的樣品特性,照射在樣品上的平均功率在 2 - 20 mW之間。為了隔離散射光,由同一水浸沒透鏡採集到的螢光信號通過一個E700SP Chroma Technology, Brattleboro, VT分光片dichroic,然后被第二個分光片分成兩束光分別進入兩個不同的探測通道。根據不同的染色體,每個通道要測量的顏色波長由選擇不同的濾色片來實現。最后,螢光信號通過自制的接口進入 100 mm直徑的光纖。使用光纖傳輸不需重新調節光學系統即可方便地轉換不同的探測器,如雪崩式光電二極管SPCM-AQR-16-FC, EGG, Vaudreuil, Quebec,光電倍增管H 7421-40, Hamamatsu, Bridgewater, NJ,光柵式分光儀Ocean Optics, Dunedin, IL等。光子計數器的輸出直接送入ALV-6000相干儀ALV GMBH, Langen, Germany,由它計算出相應的自動和交叉相干函數。最后的數據分析是在Igor Pro版本4,Wavemetrics, Lake Osergo, OR上完成。

圖1 雙色雙光子光譜測量的實驗裝置。正文中給出了各光學部件的詳細說明。

3.2 樣品制備 用于系統校准的Rhodamine 6G J. T. Baker, Phillipsburg, NJ被溶于去離子水中,在進一步稀釋前用0.01微米的過濾器過濾。染色體的濃度用吸收光譜測定。螢光NLS縮氨酸peptide和純化的improin-a蛋白質由Alec Hodel博士Department of Biochemistry, Emory University提供。脫氧核糖核酸DNA樣品購于Integrated DNA TechnologiesCoralville, IA。DNA的序列由Tubulin gene提供,為了減小自我耦合和發夾式復合Self-dimerization and hairpin ation,選用了特定的寡核甘酸oligonucleotides。兩種18mer 的單鏈核酸oligosA和B分別用Cy3.5和Oregon Green 488標志,第三種單鏈核酸 X 無任何標志,Integrated DNA Technologies還提供了DNA的純化服務HPLC用于標志的分子和PAGE用于無標志單鏈核酸。在螢光相干光譜測量中,樣品被稀釋到合適的濃度通常在10-50 nM,然后滴在玻璃樣片上Nunc, Napeville, IL,合上玻璃蓋片。所有的實驗都是在室溫下進行。

4.應用 4.1 流體動力學擴散測定 分子擴散的實驗室測試是最簡單的螢光相干光譜測量應用。圖2顯示了一鞗典型的rhodamine 6G的螢光相干光譜曲線。時間為零時的曲線幅度依賴于樣品的濃度,擬合fitting曲線隨時間衰減的特性可用來測定分子的擴散系數。圖2中曲線的擴散系數是310-6 cm2/s,它不依賴于測定方法,因此常用來校准系統的測量體積。一旦測量體積確定后,這一方法可以測定複雜環境中不同分子的擴散系數。最令人感興趣的是這種方法在活細胞中的應用[7, 15]。

圖2 水溶液中rhodamine6G的螢光自動相干曲線。曲線在時間為零時的幅度依賴于樣品濃度,曲線隨時間的衰減是由光斑大小測量體積和分子的擴散系數決定。在已知樣品濃度和擴散系數情況下,曲線可以用于測定光斑的大小。由圖2曲線確定的光斑半徑為0.3微米。

下面給出一個測量擴散系數的應用實例。該例子是測量生長在玻璃樣片上的含有強綠色螢光蛋白質enhanced green fluorescent protein, EGFP的HEK293細胞。利用雙光螢光成像術得到這些細胞的圖像后,激光可直接照射在感興趣的區域進行螢光相干光譜測量,從而能測定活細胞中不同區域內EGFP的流體運動,如圖3所示。細胞內的擴散測量提供了一種對生物體系進一步認識的方法。然而在活細胞中應用螢光相干光譜測量時需注意細胞膜可能會改變測量體積的大小和形狀,細胞的大範圍動態重組也可能嚴重地影響實驗結果,背景螢光同樣會影響相干光譜曲線。

4.2 測量分子相互作用I 擴散分析 精確地測量擴散系數同樣可以用于定量分析特定分子之間的相互作用,此應用可通過對擴散機理的分析或分子計數來實現。擴散分析diffusion based analysis和螢光偏振分析 fluorescence polarization assays很相似,它們的擴散系數均因兩個不同分子的結合而變化。其主要區別在于偏振分析基于旋轉 rotational擴散而螢 圖3 螢光相干光譜法應用于細胞內擴散測量。左含有強綠色螢光蛋白質的HEK293的雙光子螢光圖像。在該圖像中選擇感興趣的區域進行螢光相干光譜測量。右在活細胞的細胞漿cytoplasm中測量典型的螢光相干光譜曲線。平均擴散速度小於EGFP的水中擴散速度3X.不同區域內擴散速度的變化提供了一種敏感測量周圍環境及特定分子流體特性的方法。

光相干光譜法基于平移translational擴散。這里所給的例子是帶有SV40細胞核定位信號nuclear localization signal, NLS的縮氨酸和im

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